В этом году слово ПЦР прочно вошло в повседневный лексикон. С помощью ПЦР и, реже, других методов амплификации нуклеиновых кислот диагностируют SARS-CoV-2 инфекцию (об этом подробнее здесь: https://prof-afv.livejournal.com/6425.html; https://prof-afv.livejournal.com/5607.html). Однако, этот пост не о ПЦР. Я понимаю, что то, как работают методы молекулярной диагностики, явно не самое популярное чтение для широкой публики. Тем не менее, мне захотелось рассказать о методе, который, возможно, заменит ПЦР в диагностике инфекций, вызываемых РНК-содержащими вирусами. К тому же идея, и то, как она была реализована, на мой взгляд, действительно «инновационные». Что, увы, редкость. Предупреждаю, пост не лёгок для чтения.

Корни идеи этого метода лежат в открытии, удостоенном Нобелевской премии 2020 по химии. Собственно премия была присуждена за метод редактирования генома, который называется CRISPR/Cas9 (подробнее здесь: https://prof-afv.livejournal.com/45712.html). Казалось бы, какое это имеет отношение к диагностике SARS-CoV-2 инфекции? Не совсем прямое, но имеет. Дело в том что «геномные ножницы» - фермент Сas9, который  с помощью «РНК-проводников» можно точно направлять в те или иные точки ДНК - имеет «родственников». Один из них – фермент Сas13а. Его, также как Сas9, можно «направить» в нужную точку генома, но не ДНКового, а РНКового. Причём РНК-мишень для Сas13а должна быть однонитчатой. Именно таковы геномы большинства РНК-содержащих вирусов. 

Ну хорошо, Сas13а в комплексе с РНК-проводниками можно «направить» в определённые участки РНК генома вируса (в нашем случае SARS-CoV-2). Фермент-эндонуклеаза разрежет вирусную РНК в этой точке. Что дальше? Каким образом это можно использовать для детекции вируса? Вирусной РНК ведь не станет больше. А суть ПЦР и всех других методов амплификации нуклеиновых кислот это лавинообразное копирование молекул-мишеней. Этим определяется их сверхвысокая чувствительность. Как обеспечить сверхчувствительность без амплификации вирусных геномов?

Для этого авторы использовали особенность Сas13а «шинковать» все однонитчатые РНК. Но эта способность Сas13 появляется только тогда когда этот фермент с помощью РНК-проводника доставлен в нужное место РНК-мишени (т.е. вирусной РНК) и специфически связался с последней. Только в этом случае Сas13а превращается в «ножницы» для однонитчатых молекул РНК. Но опять же, сколько не «шинкуй» РНК её не становится больше. Как же сделать так, чтобы от очень небольшого количества обнаруженной вирусной РНК исходил «сигнал» настолько сильный, чтобы его можно было однозначно зарегистрировать? Для этого авторы использовали следующий «трюк» (который, кстати, применяется и в некоторых вариантах ПЦР). Суть его довольно простая. Есть вещества, способные к флюоресценции (флюорофоры) и есть другие вещества, способные флюоресценцию гасить (тушители = quenchers). Для того, чтобы «тушитель» заблокировал способность флюорофора  флюоресценцировать его молекула должна фиксировано находится в непосредственной близости от молекулы флюорофора. Если «связка» исчезает, способность флюорофора к флюоресценции восстанавливается. А теперь представьте короткую молекулу РНК на одном конце которой находится флюорофор (Ф), а на другом тушитель (Т). Флюоресценция невозможна - она погашена. А что произойдёт, если такую молекулу РНК «разрезать»? Связка Ф с Т исчезнет и флюоресценция «запылает». Схематически это изображено на рисунке (взят из статьи).

Серая «сарделька» это участок последовательности вирусной геномной РНК к которому комплиментарна «РНК-проводник» (красная сарделька). Когда РНК мишень (серая) и РНК-проводник специфически связываются, в комплексе РНК-проводник/Cas13a конфигурация фермента изменяется, и он превращается в «ножницы». Эти ножницы появляются только тогда, когда РНК-проводник специфически связывается с РНК-мишенью. Ножницы начинают «шинковать» синтетические молекулы РНК с которыми связаны  “Ф” и “Т” (они называются «РНК репортеры» = reporter RNA). Ф и Т «разводятся» и Ф восстанавливает способность флуоресцировать. Таких синтетических РНК-репортеров в реакционную смесь можно «подкинуть» много. Пока «ножницы» не активируются, с ними ничего не произойдёт.

Прототип прибора для постановки этой реакции реализован в виде небольшой коробочки, в которую вставляется обычный смарт- телефон. Телефон регистрирует сигнал, т.е. флюоресценцию (кстати, оказалось, что в этом качестве он работает даже лучше, чем стандартный лабораторный флюориметр), записывает изменение сигнала во времени и анализирует эти данные. Так выглядят это устройство и его принципиальная схема:

Этот тест имеет отличную аналитическую специфичность и чувствительность (лучше, чем у ПЦР) и позволяет проводить количественное определение геномной РНК SARS-CoV-2. Время от загрузки материала до получения результата 5-30 минут. Очевидно, что есть множество возможностей для усовершенствования и адаптации теста и его аппаратного обеспечения для практической диагностики. Чего же не хватает? Пока этим методом тестировались только образцы очищенной вирусной РНК. Адаптировать метод для тестирования реальных клинических образцов ещё предстоит. 

Для тех, кто хочет копнуть глубже, оригинал статьи здесь: https://www.cell.com/cell/pdf/S0092-8674(20)31623-8.pdf. Там же можно найти ссылки на другие методы определения РНК SARS-CoV-2, основанные на CRISPR. Один из них, кстати, называется SHERLOCK... Эти методы тоже инновационные, в хорошем смысле, но тот, о котором рассказано в посте, на мой взгляд «покруче». 

(с) Проф_АФВ